JUSTIFICACIÓN DE LA TÉCNICA Y METODOLOGÍA UTILIZADA
(FUNDAMENTO).
La electroforesis es una técnica para separar moléculas en función de su
carga eléctrica.
Consiste en aplicar una corriente eléctrica a través de una superficie
(acetato de celulosa) o una matriz porosa (gel de agarosa o de acrilamida).
La corriente se genera entre un cátodo (-) y un ánodo (+), de forma que
aquellas moléculas con carga + se desplazarán hacia el cátodo, y las que tengan
carga – irán hacia el ánodo. En este trayecto, se separarán en función a su
carga y también según su tamaño.
La hemoglobina, al ser una proteína, tiene la propiedad de ser anfótera, es
decir, puede estar cargada positivamente o negativamente según el pH del medio
Para la electroforesis, usamos un tampón del pH que nos convenga, según los componentes
que queramos separar.
IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA UTILIZADA Y DE LOS CONTROLES
EFECTUADOS EN ESA MUESTRA.
La muestra en esta práctica es un hemolizado.
MATERIAL UTILIZADO.
MATERIAL ADICIONAL
-
Tubos
de centrífuga.
-
Pipetas
Pasteur.
-
Pipetas
graduadas.
-
Centrífuga.
-
Espectrofotómetro.
-
Cubetas
de espectrofotómetro.
-
Vidrio
de reloj.
-
Bateas.
-
Probetas
de 100 ml de capacidad.
-
Placa
de vidrio.
-
Estufa.
-
Reloj.
-
Fuente
de alimentación.
-
Cubeta.
-
Puente.
-
Aplicador.
-
Medio
de soporte.
-
Fotodensitómetro.
REACTIVOS
-
Suero
fisiológico. (solución de cloruro sódico al 0,9%)
-
Agua
destilada o desionizada.
-
Cloroformo
o triclorometano (Cl3CH).
-
Tampón:
es el líquido que ioniza las proteínas.
-
Colorante,
para poner de manifiesto las bandas formadas.
-
Decolorante
para eliminar el exceso de colorante.
-
Deshidratante
(metanol)
-
Solución
transparentadora.
SECUENCIACIÓN Y PROCEDIMIENTO SEGUIDO (TÉCNICA).
1º) PREPARACIÓN DEL HEMOLIZADO
• 4
lavados + hemólisis con cloroformo
2º) ELECTROFORESIS
• Aplicación
de la muestra
• Separación
electroforética: 400V 5’
3º)
PROCESAMIENTO DE LAS TIRAS
- Negro amido 10 minutos
- Aciso acetico 10 minutos
- Metanol 1 minuto
- Solucion transparentadora 10 minutos
DESCRIPCIÓN Y REGISTRO DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON
EVALUACIÓN PERSONAL DEL ALUMNO DE LOS MISMO RESULTADOS.
Para la lectura de las bandas presentes en las tiras, se suele proceder al
transparentado de las mismas, que se realiza de la siguiente manera:
1.
Deshidratar
las tiras, sumergiéndolas en metanol durante 1 minuto.
2.
Sumergir
las tiras en una mezcla de soluciones transparentadoras preparada
recientemente.
3.
Extender
las tiras sobre una placa de vidrio, de forma que su cara absorbente quede en
contacto con el cristal y procurando que no se formen burbujas de aire al
hacerlo.
4.
Calentar
la placa en una estufa a unos 60-70 ºC, hasta que la transparencia de las tiras
sea completa.
5.
Dejar
enfriar la placa, a temperatura ambiente, durante unos minutos.
6.
Desprender
las tiras de la placa.
Los resultados de la prueba pueden apreciarse vialmente o
fotodensitométricamente.
La observación visual de las tiras transparentadas permite detectar la
presencia de bandas anómalas o de alteraciones (ausencia, adelgazamiento o
engrosamiento) en las bandas normales.
La lectura fotodensitométrica de las bandas comienza con un barrido de la
tira con un haz de luz a 520 nm, seguido de una medición de la absorbancia de
cada banda, a esa longitud de onda, que es registrada gráficamente en forma de
curvas.
El fotodensitómetro también evalúa el área que corresponde a cada curva y
proporciona el porcentaje que representa cada una de ellas con respecto al
total de las áreas. Como las áreas son directamente proporcionales a la absorbancia
producida, y ésta lo es a su vez a la cantidad de Hb presente en las bandas,
estos porcentajes expresan la cantidad existente de lo que estamos ensayando.
APLICACIÓN DEL CONTROL DE CALIDAD.
Seguir los pasos adecuadamente de la técnica y asegurarse de que todo el
material está en perfectas condiciones.
NORMAS DE SEGURIDAD Y DE PREVENCIÓN DE RIESGOS LABORALES
ESPECÍFICOS DE LA TÉCNICA.
1. Uso
de guantes y bata en el laboratorio.
2. Llevar
el pelo recogido si se tiene largo.
3. No
comer, beber o fumar en el laboratorio.
4. Uso
correcto de los reactivos.
5. Lugar
de trabajo limpio y ordenado.
6. Tomar
medidas de prevención ante riesgos de quemaduras.
CUIDADO DEL MEDIOAMBIENTE.
Dado que se utiliza bastante
cantidad de reactivos, las mezclas y demás líquidos utilizados habría que
desecharlos en la garrafa destinada a residuos.
OBSERVACIONES, COMENTARIOS Y CONCLUSIONES.
Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta
son colocadas en un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de
atracción hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir
cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el
cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran
hacia el ánodo (el polo positivo).
El movimiento de las moléculas está gobernado también por dos fuerzas adicionales; inicialmente la fricción con el solvente dificultará este movimiento originando una fuerza que se opone , por otro lado las moléculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen energía cinética propia denominado difusión. La energía cinética de las moléculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusión.
La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de una manera homogénea, de tal manera que, si las moléculas son colocadas en un cierto lugar de solución, los iones comenzaran a moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo.
Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las moléculas empleando un medio que oponga más resistencia a dicho movimiento. Una forma común de hacer esto es formar un gel. El gel consiste de un polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos, consecuentemente, la migración electroforética de las moléculas será más lenta, pero el ensanchamiento del frente se verá reducido también.
El movimiento de las moléculas está gobernado también por dos fuerzas adicionales; inicialmente la fricción con el solvente dificultará este movimiento originando una fuerza que se opone , por otro lado las moléculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen energía cinética propia denominado difusión. La energía cinética de las moléculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusión.
La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de una manera homogénea, de tal manera que, si las moléculas son colocadas en un cierto lugar de solución, los iones comenzaran a moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo.
Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las moléculas empleando un medio que oponga más resistencia a dicho movimiento. Una forma común de hacer esto es formar un gel. El gel consiste de un polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos, consecuentemente, la migración electroforética de las moléculas será más lenta, pero el ensanchamiento del frente se verá reducido también.
Hoja de trabajo
1º ¿De qué material son las tiras
empleadas en esta técnica?
Son de acetato de celulosa
2º ¿Cuál es el decolorante del
rojo Ponceau?
Es una solución acuosa de ácido acético al 5%.
3º ¿Cómo se llama el aparato que
lee las bandas de las tiras y las transforma en curvas de área mensurable?
Fotodensitómetro.
4º. ¿En qué enfermedad aparece una
banda electroforética de Hb S?
Anemia falciforme.
5º. ¿Cuál es la Hb normal más
electronegativa?
La hemoglobina S
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