Prueba cruzada mayor (21-05-15)

Justificación y metodología utilizada

Consiste en enfrentar el suero del receptor con los hematíes del donante, primero en medio salino, posteriormente en medio albuminoso y por ultimo frente al suero antiglobulina de Coombs. Con este último paso detectaremos los anticuerpos que se hayan quedado fijados a la membrana eritrocitaria

Identificación de la muestra y de los controles efectuados

Suspensión de hematíes al 5%

Material

• Tubos de centrifuga
• Centrifuga
• Baño de agua
• Pipeta Pasteur
• Gradilla
• Reloj
• Vasos de precipitados

Reactivos

• Suero fisiológico
• Albumina bovina al 30%
• Suero antiglobulina de Coombs

Secuenciación y procedimiento seguido

1. Hacer un lavado de hematíes y una suspensión al 5%
2. En un tubo de centrifuga depositas una gota de suspensión del donante y dos gotas del suero del receptor
3. Mezclamos y dejamos a temperatura ambiente 2-3 minutos
4. Centrifugamos a 3000 rpm durante 1 minuto
5. Leemos el resultado obtenido en medio salino
6. Añadimos al tubo 3 gotas de albumina bovina al 30 %
7. Mezclamos e incubamos a 37ºC durante 30 minutos 
8. Centrifugamos a 3000 rpm durante 1 minuto
9. Leemos el resultado obtenido en medio albuminoso
10. Lavamos tres veces los hematíes con suero fisiológico para eliminar los anticuerpos que no se hayan fijado a los eritrocitos. Retiramos todo el sobrenadante posible del ultimo lavado 
11. Añadimos al tubo una gota de suero antiglobulina humana de Coombs y mezclamos bien
12. Centrifugamos a 1000 rpm durante dos minutos
13. Leemos los resultados, si no aglutina se puede hacer la trasfusión

Descripción y registro de los resultados obtenidos

La lectura de los resultados se realiza resuspendiendo el botón hematico con suavidad después de cada una de las cenrifugaciones.
La ausencia de aglutinación en todos los pasos indica que las sangres son compatibles y, por tanto, la trasfusión es posible
La aglutinación en cualquiera de las fases de la prueba indica incompatibilidad
Si se observa hemolisis en cualquiera de los pasos, también es signo de imcompatibilidad
Resultado: No me ha aglutinado en ninguno de los pasos por lo tanto la trasfusión seria posible

Aplicaciones del control de calidad

El lavado inadecuado de los hematíes, la contaminación de los reactivos con trazas de suero, tiempos de incubación y centrifugado incorrectos, mal control de la temperatura e inadecuada conservación u omisión de los reactivos dan reacciones negativas falsas.

Normas de prevención de riesgos laborales

1.      Uso de guantes y bata en el laboratorio.

2.      Llevar el pelo recogido si se tiene largo.

3.      No comer, beber o fumar en el laboratorio.

4.      Uso correcto de la centrifuga y baño de agua.

5.      Lugar de trabajo limpio y ordenado.

Cuidado del medioambiente

El material utilizado en esta práctica se puede lavar en el fregador ya que los reactivos utilizados son de poca cantidad.

Los frascos hay que volver a dejarlos en su lugar, en el frigorífico del laboratorio, bien cerrados. 

Observaciones, comentarios y conclusiones

En esta práctica hay que tener especial atención en seguir los pasos correctamente y en mover los reactivos para que no de un falso positivo o un falso negativo.

Hoja de trabajo

1. ¿Que se enfrenta en la prueba cruzada mayor?
   Se enfrenta sangre y suero
2. ¿Cuando se debe realizar la prueba cruzada mayor?
   Cuando se necesita hacer una trasfusión
3. ¿Por que debemos realizar la prueba en medio salino y albumina?
   Para detectar todos los anticuerpos presentes
4. ¿Que pone de manifiesto el suero antiglobulina humana de Coombs?
   Detectamos los anticuerpos que se hayan fijado a la membrana eritrocitaria

 

Determinación sérica del grupo AB0 (27-04-15)

Justificación de la técnica y metodología utilizada

El suero de un individuo solo debe contener Ac frente a los Ag que no están presentes en sus propios hematíes. Por ello, al hacer reaccionar este suero con hematíes conocidos del grupo A y del grupo B, solo producirá aglutinación en el caso de ser enfrentados a eritrocitos con Ag distintos a los de sus propios hematíes

.

Identificación de la muestra utilizada y de los controles efectuados

La muestra que se utiliza en esta práctica es suero, aunque nosotros hemos utilizado plasma

Material utilizado

Material

·         - Tubos de ensayo

·          -   Pipetas Pasteur

·          -   Vasos de precipitados

·          - Centrifuga

- Reactivos

·          -   Suero fisiológico

Secuenciación y procedimiento seguido

1        1ºSe centrifuga la sangre y se le retira el plasma 

2        2ºEl plasma debe ser inactivado a 56 ºC durante 10 min en el caso de utilizar plasma en la practica

3        3ºSe hacen tres lavados de hematíes a esa sangre que ha quedado en el tubo después de centrifugar y se hace una suspensión de hematíes al 5%, para hacer la suspensión se cogen 250 microlitros de hematíes lavados y se echan en un tubo con 4,75 ml de suero fisiológico.

4    4º Se hace una suspensión de hematíes con cada grupo sanguíneo

5    5ºSe rotulan 5 tubos de centrifuga (A₁, A₂, B, 0 Y C)

6ºSe le añade a cada uno de esos tubos dos gotas de plasma problema y 1 gota de sus suspensión correspondiente. El tubo C lleva suspensión de sangre problema.

7ºSe agitan suavemente y se centrifugan 1 min a 1000 rpm

8        8ºSe observan 

Descripción y registro de los resultados obtenidos

El grupo eritrocitario que se asignara, según los resultados obtenidos, se puede ver en el siguiente cuadro:

Tubo A1	Tubo A2	Tubo B	Tubo 0	Tubo C	Ac  presentes en el suero	Grupo eritrocitario
-	-	+	-	-	Anti - B	A1
- o + *	-	+	-	-	Anti – B y Anti – A1*	A2
+	+	-	-	-	Anti – A	B
+	+	+	-	-	Anti – A y Anti – B	0
-	-	-	-	-	Ninguno	A1B
- O +	-	-	-	-	Ninguno o Anti – A1	A2B
+	+	+	+	+	Anticuerpos	Ininterpretable

+ = Aglutinación     
- = No Aglutinación
* = Este Anti A₁ se encuentra solo en un 2% de los individuos A₂

El resultado que he obtenido es el siguiente:

Tubo A1 –> Aglutinación

Tubo A2 --> Aglutinación

Tubo B --> Aglutinación

Tubo 0 --> No aglutinación

Tubo C --> No aglutinación

Por lo tanto según la tabla el resultado corresponde al grupo sanguíneo 0

Aplicación del control de calidad 

Para poder realizar un estudio correcto en esta práctica, los hematíes han de estar bien lavados. En caso de estar el sobrenadante coloreado, significa que ha habido hemólisis, por lo que debemos de comenzar de nuevo con el lavado de hematíes.

Para utilizar correctamente la centrífuga, los tubos a utilizar han de ser todos del mismo tamaño y en número par, para poder equilibrar la centrífuga.

Seguir correctamente las indicaciones de utilización de la centrífuga marcados en la práctica.

Normas de prevención de riesgos laborales

               1.      Uso de guantes y bata en el laboratorio.

               2.      Llevar el pelo recogido si se tiene largo.

               3.      No comer, beber o fumar en el laboratorio.

               4.      Uso correcto de la centrifugadora.

               5.      Lugar de trabajo limpio y ordenado.

Cuidado del medio ambiente

Lavar bien los tubos

Observaciones, comentarios y conclusiones

Es difícil confirmar el grupo sanguíneo por esta técnica en el caso de los recién nacidos, ya que sus anticuerpos no están bien desarrollados aun. También encontramos dificultades en los pacientes con gammaglobulinemia, ya que carecen de anticuerpos, y en aquellos que poseen unos anticuerpos específicos o inespecíficos capaces de reaccionar con los antígenos del grupo AB0

Hoja de trabajo 

1º ¿Qué son los hematíes tipados?

Son los hematies lavado con suero fisiologico

2º ¿A que dilución empleamos los hematíes del paciente?

Empleamos una dilución del 5%

3º ¿Qué clase de muestra se emplea en esta técnica?

Suero obtenido mediante coagulación de la sangre

4º ¿Qué ocurre cuando el tubo C presenta aglutinación?

Cuando el tubo C presenta aglutinación se deberia repetir las pruebas con otro lavado de hematies ya que el tubo C debe ser un control negativo

Determinación celular en tubo (23-04-15)

JUSTIFICACIÓN DE LA TÉCNICA Y METODOLOGÍA UTILIZADA (FUNDAMENTO).

El fundamento de esta práctica es la misma que la práctica XXIX: "Determinación celular en porta", pero en esta ocasión se realiza en tubos.

Los hematíes problema, contienen las sustancias antigénicas del sistema ABO y se enfrentan a sueros conocidos que poseen anticuerpos frente a esos antígenos.

El resultado final, como en la otra práctica, es la presencia o no de aglutinación en los hematíes reaccionantes.

IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA UTILIZADA Y DE LOS CONTROLES EFECTUADOS EN ESA MUESTRA.

La muestra en esta práctica es de sangre total anticoagulada suspendida al 2%.

MATERIAL UTILIZADO.

MATERIAL ADICIONAL

-   Papel de filtro.

-   tubos de centrífuga.

-   Centrifuga.

-   Pipetas Pasteur de vidrio.

-   Rotulador de vidrio.

-   Gradilla.

-   Bata y guantes.

-   Pipetas

-   Prepipetas

-   Micropipeta.

-   Puntas de Pipetas

-   Vidrio de reloj.

-   Balanza.

-   Pinzas.

-   Cucharilla.

-   Vaso de precipitado.

-   Matraz aforado de 100 ml.

-   Frasco lavador.

-   Embudo

-   Parafilm o tapones

REACTIVOS

·         Suero anti-A

·         Suero anti-B

·         Suero anti-AB

·         Solución salina fisiológica

SECUENCIACIÓN Y PROCEDIMIENTO SEGUIDO (TÉCNICA).

1.      Lavamos los hematíes 3 veces.

-        Preparamos un tubo con 1 ml sangre y 3 ml de suero fisiológico y otro con 4 ml agua para calibrar la centrífuga y centrifugamos durante 3 minutos a 2.500 rpm.

-        Quitamos el sobrenadante y volvemos a echar 3 ml de suero. Volvemos a centrifugar.

2.      Preparamos una suspensión al 2%

C₁ x V ₁= C₂ x V₂

5 x V₁ = 2 x 2  -->  V1 = 0,8 ml

Para la suspensión al 2%, cogeríamos 0,8 ml de la suspensión al 5% y le añadiríamos 1,2 ml de suero fisiológico. Se tapa con parafilm y se homogeneíza.

3.      En tres tubos diferentes y rotulado ponemos una gota de los hematíes, preparados en la suspensión, con dos gotas de anti-A en un tubo, dos gotas de anti-B en otro tubo y otras dos gotas de anti-AB en el tercer tubo.

4.      Centrifugamos los tubos durante 1 minuto a 1000 rpm, con un cuarto tubo con tres gotas de agua para calibrar la centrífuga.

DESCRIPCIÓN Y REGISTRO DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON EVALUACIÓN PERSONAL DEL ALUMNO DE LOS MISMO RESULTADOS.

Después de centrifugar, golpeamos suavemente el fondo de cada tubo para desprender el sedimento y observar macroscópicamente la presencia o la ausencia de aglutinación.

Reacción negativa: los hematíes se suspenden homogéneamente.

Reacción positiva: Se observa un botón de hematíes que permanecen unidos una vez desprendidos el sedimento.

La interpretación clínica se hace igual que en la técnica en porta.

El resultado es ninguna aglutinacion en ningun tubo, por lo tanto el grupo sanguineo es 0

APLICACIÓN DEL CONTROL DE CALIDAD.

Para poder realizar un estudio correcto en esta práctica, los hematíes han de estar bien lavados. En caso de estar el sobrenadante coloreado, significa que ha habido hemólisis, por lo que debemos de comenzar de nuevo con el lavado de hematíes.

Para utilizar correctamente la centrífuga, los tubos a utilizar han de ser todos del mismo tamaño y en número par, para poder equilibrar la centrífuga.

Seguir correctamente las indicaciones de utilización de la centrífuga marcados en la práctica.

NORMAS DE SEGURIDAD Y DE PREVENCIÓN DE RIESGOS LABORALES ESPECÍFICOS DE LA TÉCNICA.

1.      Uso de guantes y bata en el laboratorio.

2.      Llevar el pelo recogido si se tiene largo.

3.      No comer, beber o fumar en el laboratorio.

4.      Uso correcto de la centrifugadora.

5.      Lugar de trabajo limpio y ordenado.

CUIDADO DEL MEDIOAMBIENTE.

Dado que las cantidades de los reactivos utilizados son muy pequeñas, los tubos utilizados se lavan con normalidad en el fregador.

OBSERVACIONES, COMENTARIOS Y CONCLUSIONES.

En el momento de interpretar los datos, hay que destacar que los restos de detergente o sustancias extrañas en los tubos, pueden ocasionar falsos positivos

Además, se pueden dar casos de falsos positivos por dos motivos:

-        Aglutinación no específica, debido a la presencia de ácido hialurónico en la sangre, procedente de la gelatina de Wharton del cordón umbilical. Se elimina añadiendo una gota de hialuronidasa a la suspensión de hematíes.

-        Fenómeno de Rouleaux: Consiste en una agrupación no específica de hematíes, que adoptan una imagen de pilas de monedas. Las sustancias que más frecuentemente originan este fenómeno son el fibrinógeno, las gammaglobulinas, el dextrano y la polivinilpirrolidona.

Estos fenómenos se pueden evitar con el lavado previo de los hematíes problema.

Hoja de trabajo

1º ¿Qué tipo de técnica inmunológica se emplea en este análisis?

Se emplea la técnica en tubo.

2º ¿A qué concentración se prepara la suspensión de hematíes problemas?

Se prepara al 2%, para lo que se mezclan 4,9 ml de suero fisiológico con 0,1 de hematíes lavados.

3º ¿Cómo se ve la aglutinación positiva?

La aglutinación positiva es cuando los hematíes resuspenden homogéneamente.

4º. ¿Cómo se pueden evitar los falsos positivos?

Los falsos positivos que se pueden dar son:

-        Aglutinación no específica, debido a la presencia de ácido hialurónico en la sangre, procedente de la gelatina de Wharton del cordón umbilical. Se elimina añadiendo una gota de hialuronidasa a la suspensión de hematíes.

-        Fenómeno de Rouleaux: Consiste en una agrupación no específica de hematíes, que adoptan una imagen de pilas de monedas. Las sustancias que más frecuentemente originan este fenómeno son el fibrinógeno, las gammaglobulinas, el dextrano y la polivinilpirrolidona.

Estos falsos positivos se pueden evitar con el lavado de los hematíes problema.