Determinación Du (20-05-15)

JUSTIFICACIÓN DE LA TÉCNICA Y METODOLOGÍA UTILIZADA.

En algunos casos, los anticuerpos tipo IgG (o incompletos) son incapaces de producir la aglutinación de los hematíes por sí solos. Sin embargo, son capaces de adherirse a su superficie tato in vivo como in vitro, y decimos que han sensibilizado a los hematíes. También son capaces de fijar el complemento, sin llegar a producir la hemólisis de los eritrocitos.

Estos anticuerpos de tipo IgG, pueden reaccionar con un suero de conejo en el que existen anticuerpos antiglobulina humana del tipo IgM (completos). Como resultado de esta reacción es la aglutinación de los hematíes.

Este suero antiglobulina humana es lo que se conoce como suero de Coombs, que puede ser de dos tipos:

·         Poliespecífico, si está dirigido contra la IgG o contra el componente C3d del complemento.

·         Monoespecífico, si está dirigido sólo contra la IgG o contra alguno de los componentes de complemento.

La prueba de Combs o de la antiglobulina humana puede realizarse de dos modos:

1.      Prueba directa, donde intentamos detectar anticuerpos incompletos que han sensibilizado a los hematíes in vivo y para lo que enfrentamos directamente el suero de Combs y observamos si existe o no, aglutinación.

2.      Prueba indirecta, donde el paso previo es la sensibilización de los eritrocitos in vitro, para posteriormente hacerlos reaccionar con el suero de Combs. En este caso se buscan anticuerpos incompletos libres en el suero, o poner de manifiesto la presencia de antígenos débiles en la membrana de los hematíes

El D^u es un antígeno débil que no se pone de manifiesto en las pruebas normales de determinación del Rh. Por ello se debe sensibilizar previamente los hematíes problema con un suero que contiene anticuerpos D, y posteriormente enfrentarlos al suero de Coombs. Si existe el antígeno D^u en la superficie de los eritrocitos, se producirá la unión de los anticuerpos anti-D a sus receptores de membrana, y en la segunda fase darán lugar a la aglutinación en presencia del suero antiglobulina humana.

Esta práctica es, por tanto, una prueba de Combs indirecta.

IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA UTILIZADA Y DE LOS CONTROLES EFECTUADOS EN ESA MUESTRA.

Hematíes de la sangre problema previamente lavados tres veces en solución salina fisiológica y suspendidos al 5% en dicha solución.

MATERIAL UTILIZADO.

-   Papel de filtro.

-   Bata y guantes.

-   Tubos de centrífuga.

-   Tapones.

-   Centrífuga.

-   Baño de agua.

-   Pipetas Pasteur de vidrio.

-   Reloj.

-   Gradilla.

-   Micropipetas

-   Puntas de micropipetas.

REACTIVOS

·         Suero anti-D humano.

·         Suero antiglobulina humana de conejo (suero de Combs)

·         Solución salina fisiológica

SECUENCIACIÓN Y PROCEDIMIENTO SEGUIDO (TÉCNICA).

1.      Lavar los hematíes tres veces como en la práctica anterior.

2.      Preparar la suspensión de hematíes al 5% con 1,9 ml de suero y 0,1 ml de hematíes lavados.

3.      En un tubo, poner una gota de suero anti-D y una gota de suspensión de hematíes al 5%.

4.      Mezclar bien e incubar a 37ºC durante 35-40 minutos.

5.      Volver a lavar los hematíes incubados tres veces más con 3 ml de suero.

6.      Añadir una gota del suero Coombs y mezclar suavemente.

7.      Centrifugar a 1000 rpm durante un minuto.

DESCRIPCIÓN Y REGISTRO DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON EVALUACIÓN PERSONAL DEL ALUMNO DE LOS MISMO RESULTADOS.

Para la lectura de resultados observamos la aparición o no de aglutinación, mediante golpes suaves en el fondo del tubo. En caso de duda, se observa al microscopio entre porta y cubreobjetos con el microscopio de 40x.

Si existe aglutinación, el resultado es positivo e indica que la membrana de los hematíes hay antígeno D^u y se clasifica la sangre como Rh positivo variante de D^u.

En el caso de no existir aglutinación, la sangre se clasifica como Rh negativo

El resultado que he obtenido es que no me a aglutinado en ninguno de los pasos por lo tanto el Rh es negativo  

APLICACIÓN DEL CONTROL DE CALIDAD.

Con el fin de evitar falsos positivos, debido a una sensibilización de los hematíes in vivo, se debe realizar una prueba de Coombs directa con los hematíes problema, lo que servirá como control negativo.

También hay que asegurarse de que los reactivos no estén caducados y trabajar con la muestra por un periodo de tiempo no superior a 72 horas.

El lavado inadecuado de los hematíes, la contaminación de los reactivos con trazas de suero, tiempos de incubación y centrifugado incorrectos, mal control de la temperatura e inadecuada conservación u omisión de los reactivos dan reacciones negativas falsas.

NORMAS DE SEGURIDAD Y DE PREVENCIÓN DE RIESGOS LABORALES ESPECÍFICOS DE LA TÉCNICA.

1.      Uso de guantes y bata en el laboratorio.

2.      Llevar el pelo recogido si se tiene largo.

3.      No comer, beber o fumar en el laboratorio.

4.      Uso correcto de la centrifuga y baño de agua.

5.      Lugar de trabajo limpio y ordenado.

CUIDADO DEL MEDIOAMBIENTE.

Tanto los tubos como el material utilizado, se pueden lavar en el fregador.

OBSERVACIONES, COMENTARIOS Y CONCLUSIONES.

A diferencia de la prueba de Coombs directa, la prueba indirecta se basa en la "incubación" del suero del paciente con una muestra de sangre tipo O, y posteriormente se procede a administrar el "anti-suero". A diferencia de la prueba directa, en la prueba indirecta se busca la presencia de "anticuerpos" en el suero del paciente y no "anticuerpos" pegados a la superficie de los glóbulos rojos. La prueba indirecta se usa para realizar "tipificación" de grupos sanguíneos, pruebas sanguíneas cruzadas y como método de rastreo para evitar reacciones transfusionales.

HOJA DE TRABAJO

1º ¿Qué contiene el suero de Coombs?

El suero de Coombs contiene suero de conejo anti-IgG humana purificada.

2º ¿Qué se detecta con la prueba directa?

Con la prueba directa de Coombs se detecta anticuerpos incompletos que han sensibilizado a los hematíes in vivo.

3º ¿Qué podemos detectar con la prueba indirecta?

Con la prueba indirecta, podemos detectar los anticuerpos incompletos libres en el suero o poner de manifiesto la presencia de antígenos débiles en la membrana de los hematíes

4º. ¿Qué buscamos en la sangre del paciente?

Antígenos D^u

5º. ¿Qué ocurre si el control es positivo?

Si el resultado obtenido es positivo, nos indica que en la membrana de los hematíes hay antígeno D^u y se clasifica como Rh+ Variante de D^u.