JUSTIFICACIÓN DE LA TÉCNICA Y METODOLOGÍA UTILIZADA
(FUNDAMENTO).
El
estudio de la fragilidad osmótica de los hematíes valora la resistencia de los eritrocitos
a soluciones de presión osmótica decreciente, en condiciones constantes
de pH y de temperatura. Para ello, se enfrentan los hematíes problema a
soluciones tamponadas de cloruro sódico cuya concentración es decreciente a
partir de 9 gramos por mil (soluciones hipotónicas).
Cuando
los eritrocitos están en contacto con soluciones hipotónicas, penetra agua
através de su membrana y se hinchan. Al hincharse los hematíes, una parte de la
Hb quecontienen puede salir al exterior a través de los poros de su membrana.
Si la entrada deliquido es excesiva, los hematíes se rompen y dejan libre toda
la Hb que engloban(hemólisis).
En
condiciones normales, un eritrocito puede aceptar sin hemolizarse una entrada
de agua que incremente su volumen en un 70% como máximo.
Esta
prueba evalúa por tanto la capacidad que tienen los glóbulos rojos de soportar
unincremento tenido acuoso (resistencia osmótica eritrocitaria o ROE). Dentro
de una misma sangre la ROE de los hematíes varia de unos a otros.
IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA UTILIZADA Y DE LOS CONTROLES
EFECTUADOS EN ESA MUESTRA.
La muestra en esta práctica es de sangre total.
MATERIAL UTILIZADO.
MATERIAL
Pipetas Pasteur.
Tubos de centrífuga iguales.
Reloj.
Gradilla.
Matraz aforado de 100 ml.
Pipetas y Prepipetas.
Bata y gantes
Lancetas y algodón.
Embudo
REACTIVOS
-
Suero
fisiológico, preferiblemente, tamponado a pH fisiológico (7,4). Esta solución
salina puede prepararse de la siguiente forma:
-
9 g
de cloruro sódico (NaCL)
-
2,7
g de fosfato sódico di-básico (Na2HPO412H2O)
-
0,2
g de fosfato sódico mono-básico (NaH2PO42H2O)
-
1000
ml de agua destilada
-
Agua
destilada
§ SECUENCIACIÓN Y PROCEDIMIENTO SEGUIDO (TÉCNICA).
1. Preparar
una batería de soluciones de cloruro sódico, a concentraciones decrecientes, de
la forma que indica a continuación:
Tubo
nº
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
13
|
14
|
15
|
16
|
17
|
18
|
Agua
destilada
(Gotas)
|
0
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
13
|
14
|
15
|
16
|
17
|
Suero
fisiológico tamponado
(gotas)
|
18
|
17
|
16
|
15
|
14
|
13
|
12
|
11
|
10
|
9
|
8
|
7
|
6
|
5
|
4
|
3
|
2
|
1
|
Concentración
obtenida
(en
g/l)
|
9
|
8,5
|
8
|
7,5
|
7
|
6,5
|
6
|
5,5
|
5
|
4,5
|
4
|
3,5
|
3
|
2,5
|
2
|
1,5
|
1
|
0,5
|
Hay kits comerciales, para la
realización de esta prueba, que consisten en una batería de soluciones,
tamponadas y estabilizadas, de cloruro sódico a distintas concentraciones.
2. Añadir
a cada tubo 1 gota (0,05 ml = 50 µl) de sangre completa.
Esto ha de hacerse de forma que la
gota llegue a la solución de cloruro sódico sin que toque la pared interna del
tubo.
3. Agitar
suavemente los tubos.
4. Dejar
los tubos en reposo, al menos 30 minutos, a temperatura ambiente (unos 25 °C)
5. Centrifugar
los tubos a 2000 revoluciones por minuto (rpm), durante 5 minutos. En vez de
centrifugar los tubos, también se pueden dejar simplemente en reposo, durante 3
horas.
§ DESCRIPCIÓN Y REGISTRO DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON EVALUACIÓN
PERSONAL DEL ALUMNO DE LOS MISMO RESULTADOS.
La lectura de resultados puede ser visual o espectrofotométrica. En ambos
casos, lo que se valora es la presencia o la ausencia de hemólisis en los
tubos.
Si la lectura es visual, se considera que no hay hemólisis cuando en el
tubo se observa un sedimento en forma de botón rojizo y un líquido sobredenante
incoloro y trasparente. Sin embargo, se estima que hay una hemólisis parcial
cuando se advierte la presencia de un botón sedimentario, pero que se acompaña
de un sobredenante rojizo y transparente. Y, finalmente, se considera que la
hemólisis es total cuando solo se aprecia la existencia de un líquido rojizo y
transparente.
Si los eritrocitos presentes en el botón sedimentario de cualquier tubo se
resuspende mediante agitación. el sobredenante se enturbiará.
En los primero tubos no se ha
producido la hemólisis, ya que se puede apreciar el botón rojo en líquido
transparente, mientras que, según avanza el número de tubos, el sobredenante
empieza a enturbiarse, por lo que podemos decir que se está o que se ha
producido la hemólisis. En los primeros tubos no hay hemólisis, en los medios
se puede apreciar una hemólisis parcial y en los últimos, la hemólisis es total.
En la lectura espectrófotometrica el tubo nuemero uno da 0 y conforme vaya disminuyendo la concentracion de los tubos mayor será la absorvancia
APLICACIÓN DEL CONTROL DE CALIDAD.
El estudio que se ha realizado es visual, por lo que los únicos controles
de calidad que hay que aplicar son los relacionados a la centrífuga, el respeto
de los tiempos y tener especial cuidado en la observación de no agitar los
tubos para no mezclar el sobredenante y realizar correctamente la visualización
de los tubos.
NORMAS DE SEGURIDAD Y DE PREVENCIÓN DE RIESGOS LABORALES
ESPECÍFICOS DE LA TÉCNICA.
1. Los
relacionados con la centrífuga
2. Uso
de guantes y bata en el laboratorio.
3. Llevar
el pelo recogido si se tiene largo.
4. No
comer, beber o fumar en el laboratorio.
5. Uso
correcto de la centrifugadora.
6. Lugar
de trabajo limpio y ordenado.
CUIDADO DEL MEDIOAMBIENTE.
Como no se han utilizado reactivos,
las muestras se pueden desechar en el fregador y utilizar jabones suaves para
lavar los tubos.
OBSERVACIONES, COMENTARIOS Y CONCLUSIONES.
La fragilidad osmótica
eritrocitaria es a menudo realizada en los estudios de posibles casos de
esferocitosis hereditaria. Esta prueba no ayuda a diferenciar los esferocitos
de la esferocitosis hereditaria de la anemia hemolítica autoinmune adquirida;
este test solo indica que una proporción de células rojas tiene una disminución
de la relación de la superficie y el volumen y son más susceptibles a la lísis
en las soluciones hipo-osmóticas.
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