Tradicionalmente, las tinciones se han logrado mediante el uso de colorantes que, con frecuencia, derivan de tinciones tradicionales o clásicos pero también hay combinaciones de colores que dan lugar a tinciones policrómicas. Una coloración es panóptica cuando se utilizan sucesivas sustancias colorantes neutras y es pancrómica cuando se aplican todas las sustancias colorantes neutras juntas.
El primero que tuvo la idea de realizar una de estas combinaciones fue Romanowsky y los colorantes hematológicos utilizados en la actualidad suelen derivar del que él preparó.
Los colorantes de tipo Romanowsky constan de un colorante ácido (eosina) y de colorantes básicos (tiazinas). Las tiazinas son el azul de metileno y sus derivados obtenidos por desmetilización oxidativa (colorantes tipo azur)
Las tinciones realizadas con colorantes de tipo Romanowsky son la de Wright y la de Giemsa, que utilizan azul de metileno y sus productos de oxidación (azur A, azur B y azur C) como colorantes básicos, combinándolos con la eosina como colorante ácido.
De este modo, tenemos una tinción diferencial, es decir, una tinción que es capaz de discriminar entre las distintas estructuras celulares según se tiñan éstas con colorante ácido, con colorante básico o con la mezcla de ambos.
Según la proporción de azul de metileno y de eosina que compongan el colorante, tendremos distintos métodos de tinción, siendo los más conocidos:
1. el
método Giemsa.
2. el
de Wright.
3. el
de Leishman.
4. el
de Panóptico Pappenhein
Para esta practica he utilizado sangre capilar
Material utilizado
El material que he utilizado para hacer esta practica es el siguiente:
- Gasas
- Lancetas
- Capilares
- Portaobjetos
- Pipetas Pasteur
- Puente de tinción
- Cristalizador
- Tubos de ensayo
- Pipetas automáticas
Los reactivos que he utilizado son:
- Alcohol
- Colorante en solución según Giemsa
- Solución tampón pH 7,2
- Metanol
- Aceite de inmersión
- Sangre
- Preparamos un frotis sanguíneo
- Colocamos el frotis sobre el puente de tinción, en el cristalizador
- Cubrimos el frotis con metanol durante 3 minutos. Escurrimos y lo dejamos secar al aire
- Diluimos en un tubo de ensayo 0,2 ml de Giemsa con 2 ml de solución tampón pH 7,2
- Mezclamos en el tubo y con una pipeta Pasteur cubrimos el frotis dejándolo actuar 25 minutos
- Escurrimos y lavamos primero con agua del grifo y después con tampón pH 7,2 y dejamos escurrir en posición vertical
Cuando está seca la tinción, la ponemos en el microscopio, pero no miramos directamente con el objetivo de inmersión, sino con el de 40x.
Cuando lo tenemos localizadas las células teñidas, bajamos la platina y, con el revólver, colocamos a mitad entre el de 40x y el de 100x. Ponemos una gota de aceite de inmersión y subimos la platina hasta que la muestra toque el aceite.
Con esta técnica, podemos observar que:
-
Los eritrocitos se tiñen de color rosa
asalmonado y las plaquetas de color violeta
-
Los neutrófilos presentan el núcleo de
color azul violeta, el citoplasma rosa y la granulación de
un color pardo o violeta rojizo
un color pardo o violeta rojizo
-
Los eosinófilos se observan con el núcleo
azul violeta, el citoplasma azul y los gránulos de
color rojo anaranjado
color rojo anaranjado
-
Los basófilos presentan un núcleo de color
púrpura y granulación de color azul oscuro.
-
Los monocitos y linfocitos se observan con
un núcleo color violeta y el citoplasma azul, un
poco más claro en el monocito.
poco más claro en el monocito.
En esta práctica debemos tener especial cuidado en las extensiones y en las observaciones de la muestra en el microscopio.
En cuanto a las extensiones, debemos tener suficiente formación ya que somos nosotros los que, en un futuro, tendremos que validar la calidad de los extendidos, la coloración, etc.
En la observación al microscopio de la muestra, esta debemos realizarla en varios microscopios para compararla y poder validarla. Debemos comprobar el buen funcionamiento de cada uno de los microscopios que se utilicen y manejarlos correctamente, siguiendo el protocolo de utilización.
Normas de prevención de riesgos laborales
Las normas de prevención que debemos adoptar en esta práctica son:
-
Uso de bata y de guantes apropiados.
-
Si se tiene el pelo largo, llevarlo
recogido.
-
Lavarse las manos antes y después de la
práctica.
-
Los envases hay que dejarlos bien
cerrados, guardados en un ambiente seco y a temperatura
ambiente.
ambiente.
-
En caso de vertido accidental, recoger en
seco y depositar en contenedores de residuos para su
posterior eliminación de acuerdo con las normativas vigentes. Limpiar los restos con agua
abundante.
posterior eliminación de acuerdo con las normativas vigentes. Limpiar los restos con agua
abundante.
-
Desechar las lancetas, los capilares y los
colorantes sobrantes en sus correspondientes
contenedores.
contenedores.
-
Lavar y desinfectar adecuadamente los
portaobjetos y los tubos de ensayo.
-
Mantener el puesto de trabajo limpio y
ordenado.
Cuidado del medio ambiente
No se debe verter los colorantes por el fregador. Hay que desecharlo en un contenedor específico para vertidos para, posteriormente, ser eliminados, según la normativa vigente, como vertidos tóxicos.
Desechar las lancetas, los capilares, pipetas y los colorantes sobrantes en sus correspondientes contenedores.
Observaciones, comentarios y conclusiones
Se hace en microscopio óptico de gran aumento con objetivo de inmersión en aceite, esto permite ver detalles de la cromatina de los núcleos y dilucidar correctamente las estructuras observadas.
En la dilución, al ser tan poca la cantidad, en lugar de voltear el tubo es recomendable mezclarlo con la pipeta.
Hoja de trabajo
1. ¿Cuáles son los anticoagulantes mas adecuados para esta técnica?
Son Heparina y EDTA
2. ¿Con que reactivo fijamos el frotis?
Con metanol
3. ¿Cuánto tiempo debe dejarse actuar el colorante en el frotis?
25 minutos
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