PCR son las siglas en inglés de Polymerase Chain Reaction o Reacción en Cadena de la Polimerasa. La idea básica de la técnica es sintetizar muchas veces un fragmento de ADN utilizando una polimerasa que puede trabajar a temperaturas muy elevadas, ya que proviene de la bacteria Thermus aquaticus que vive a altas temperaturas (79ºC a 85ºC), de ahí su nombre comercial más conocido: taq polimerasa.
Identificacion de la muestra utilizada
Células de la mucosa bucal
Material
- Hisopos
- Tubos de vidrio
- Microtubos
- Micropipeta
- Puntas de micropipeta
- Calentador para eppendorf
- Vaso de precipitado
- Pipetas de vidrio graduadas
- Centrifuga especial
- Pipetas Pasteur
- Termociclador
- Balanza electrónica
- Vidrio de reloj
- Cucharilla
- Microondas
- Varilla de vidrio
- Probeta
- Material para electroforesis
- Portas
- Matraz aforado
- Visualizador
- Luz ultravioleta
- Suero fisiológico
- Matriz instagene
- Oligo 1 y oligo 2
- Tampón 1xTBE
- Agarosa
- Glicerol al 30%
- Tampones de carga
- Colorante de nucleotidos
- Con la ayuda de un hisopo frotamos la pared de la mucosa bucal
- Depositamos el hisopo en 3 ml de suero fisiológico y removemos el suero con el hisopo
- De esta mezcla cogemos 1,4 ml y lo depositamos en un eppendorf
- Centrifugamos a 8000 rpm durante 8 minutos
- Retiramos el sobrenadante con la ayuda de una pipeta de vidrio
- Añadimos 70 microlitos de matriz instagene y movemos con la punta de la micropipeta
- Incubamos 10 minutos a 100ºC y enfriamos a temperatura ambiente
- Centrifugamos a 13000 rpm durante 30 segundos
- Pasamos 10 microlitro a un microtubo y metemos el el congelador para conservar
- Descongelamos la muestra
- En el tubo Ready to go PCR añadimos 18,5 microlitros de agua destilada con ayuda de una micropipeta, 2 microlitros de oligo 1 y otros 2 microlitros de oligo 2 (son los primers o cebadores), por último añadimos 2,5 microlitros de la muesta de ADN que se estaba descongelando
- Le damos un golpe de centrifuga
- Pasamos los tubos Reade to go PCR al termociclador sin agitarlos
- Esperamos a que se realicen los ciclos
- Pesamos en la balanza 1,5 de agarosa, lo disolvemos en 10 ml y enrasamos con agua destilada en un matraz aforado de 100 ml
- Fundimos la agarosa completamente en el microondas
- Dejamos enfriar y añadimos 5 microlitros del colorante de nucleotidos
- Depositamos el gel de agarosa en la bandeja de electroforesis
- Dejamos solidificar
- Una vez solidificado cubrimos con tampón 1xTBE
- Quitamos lo peines con cuidado de no romper los pocillos
- Colocamos el control en los dos pocillos de los extremos superiores y en los dos de los extremos inferiores
- En el resto de los pocillos ponemos 5 microlitros del tampón de carga correspondiente y 5 microlitros de la muestra de ADN
- Le aplicamos la corriente, 120 voltios durante 30 minutos
- Una vez finalizada la electroforesis se visualizan los fragmentos mediante luz ultravioleta
Teniendo en cuenta que el control haya salido bien las bandas de los pocillos indican el resultado de esta practica con respecto al control.
Aplicaciones del control de calidad
Debemos comprobar que el control sea correcto
Normas de prevención de riesgos laborales
1. Uso
de guantes y bata en el laboratorio.
2. Llevar
el pelo recogido si se tiene largo.
3. No
comer, beber o fumar en el laboratorio.
4. Uso
correcto de la centrifuga y baño de agua.
5. Lugar
de trabajo limpio y ordenado.
Cuidado del medio ambiente
Se deberán lavar todos los materiales como correspondan y se deberán desechar los reactivos a su lugar correspondiente
Observaciones, comentarios y conclusiones
El importante tener en cuenta que cuando se vaya a utilizar la PCR la secuencia de oligonucleotidos que se usara como cebador es uno de los parámetros mas importantes debido a su alta sensibilidad y a que puede ser muy susceptible a contaminarse, por eso es importante tener un ADN de control negativo para controlar esta variable, se deben separar las áreas de las muestras pre PCR, los productos de la reacción post PCR, las soluciones y esterilizar los materiales
Cuidado del medio ambiente
Se deberán lavar todos los materiales como correspondan y se deberán desechar los reactivos a su lugar correspondiente
Observaciones, comentarios y conclusiones
El importante tener en cuenta que cuando se vaya a utilizar la PCR la secuencia de oligonucleotidos que se usara como cebador es uno de los parámetros mas importantes debido a su alta sensibilidad y a que puede ser muy susceptible a contaminarse, por eso es importante tener un ADN de control negativo para controlar esta variable, se deben separar las áreas de las muestras pre PCR, los productos de la reacción post PCR, las soluciones y esterilizar los materiales
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