Prueba cruzada mayor (21-05-15)

Justificación y metodología utilizada

Consiste en enfrentar el suero del receptor con los hematíes del donante, primero en medio salino, posteriormente en medio albuminoso y por ultimo frente al suero antiglobulina de Coombs. Con este último paso detectaremos los anticuerpos que se hayan quedado fijados a la membrana eritrocitaria

Identificación de la muestra y de los controles efectuados

Suspensión de hematíes al 5%

Material

• Tubos de centrifuga
• Centrifuga
• Baño de agua
• Pipeta Pasteur
• Gradilla
• Reloj
• Vasos de precipitados

Reactivos

• Suero fisiológico
• Albumina bovina al 30%
• Suero antiglobulina de Coombs

Secuenciación y procedimiento seguido

1. Hacer un lavado de hematíes y una suspensión al 5%
2. En un tubo de centrifuga depositas una gota de suspensión del donante y dos gotas del suero del receptor
3. Mezclamos y dejamos a temperatura ambiente 2-3 minutos
4. Centrifugamos a 3000 rpm durante 1 minuto
5. Leemos el resultado obtenido en medio salino
6. Añadimos al tubo 3 gotas de albumina bovina al 30 %
7. Mezclamos e incubamos a 37ºC durante 30 minutos 
8. Centrifugamos a 3000 rpm durante 1 minuto
9. Leemos el resultado obtenido en medio albuminoso
10. Lavamos tres veces los hematíes con suero fisiológico para eliminar los anticuerpos que no se hayan fijado a los eritrocitos. Retiramos todo el sobrenadante posible del ultimo lavado 
11. Añadimos al tubo una gota de suero antiglobulina humana de Coombs y mezclamos bien
12. Centrifugamos a 1000 rpm durante dos minutos
13. Leemos los resultados, si no aglutina se puede hacer la trasfusión

Descripción y registro de los resultados obtenidos

La lectura de los resultados se realiza resuspendiendo el botón hematico con suavidad después de cada una de las cenrifugaciones.
La ausencia de aglutinación en todos los pasos indica que las sangres son compatibles y, por tanto, la trasfusión es posible
La aglutinación en cualquiera de las fases de la prueba indica incompatibilidad
Si se observa hemolisis en cualquiera de los pasos, también es signo de imcompatibilidad
Resultado: No me ha aglutinado en ninguno de los pasos por lo tanto la trasfusión seria posible

Aplicaciones del control de calidad

El lavado inadecuado de los hematíes, la contaminación de los reactivos con trazas de suero, tiempos de incubación y centrifugado incorrectos, mal control de la temperatura e inadecuada conservación u omisión de los reactivos dan reacciones negativas falsas.

Normas de prevención de riesgos laborales

1.      Uso de guantes y bata en el laboratorio.

2.      Llevar el pelo recogido si se tiene largo.

3.      No comer, beber o fumar en el laboratorio.

4.      Uso correcto de la centrifuga y baño de agua.

5.      Lugar de trabajo limpio y ordenado.

Cuidado del medioambiente

El material utilizado en esta práctica se puede lavar en el fregador ya que los reactivos utilizados son de poca cantidad.

Los frascos hay que volver a dejarlos en su lugar, en el frigorífico del laboratorio, bien cerrados. 

Observaciones, comentarios y conclusiones

En esta práctica hay que tener especial atención en seguir los pasos correctamente y en mover los reactivos para que no de un falso positivo o un falso negativo.

Hoja de trabajo

1. ¿Que se enfrenta en la prueba cruzada mayor?
   Se enfrenta sangre y suero
2. ¿Cuando se debe realizar la prueba cruzada mayor?
   Cuando se necesita hacer una trasfusión
3. ¿Por que debemos realizar la prueba en medio salino y albumina?
   Para detectar todos los anticuerpos presentes
4. ¿Que pone de manifiesto el suero antiglobulina humana de Coombs?
   Detectamos los anticuerpos que se hayan fijado a la membrana eritrocitaria

 

Determinación rápida de hemoglobina (22-05-15)

JUSTIFICACIÓN DE LA TÉCNICA Y METODOLOGÍA UTILIZADA (FUNDAMENTO).

Para poder determinar la concentración de hemoglobina, justo antes de una donación, es necesario un método rápido.

En las normas para la selección de donantes de sangre se establece que la concentración de Hb debe ser determinada cada vez que haya una donación.

Además, se señala que los valores mínimos antes de donar han de ser los siguientes:

-              12,5 g/dl, en el caso de mujeres.

-              13,5 g/dl en el cado de varones.

Las donaciones sólo podrán aceptarse por debajo de estos niveles si el criterio del médico responsable así lo considera oportuno.

Para determinar la concentración de hemoglobina, justo antes de una donación, es necesario un método rápido aunque no sea muy preciso.

Esta determinación rápida de la Hb se basa en el hecho de que una sangre con una concentración de Hb superior a la permitida, para poder efectuar una donación, tiene una densidad mayor a la de una solución de sulfato de cobre previamente preparada. Por lo que, en estas circunstancias, una gota de la sangre investigada cae libremente a través de la solución de sulfato de cobre.

Para donantes varones se debe preparar una solución de sulfato de cobre de densidad igual a 1,054 g/cm³, ya que a través de esta solución cae libremente una gota de sangre con Hb a una concentración superior a 13 g/dl.

Para mujeres donantes se debe preparar una solución de sulfato de cobre de densidad igual a 1,052 g/cm³, ya que a través de esta solución cae libremente una gota de sangre con Hb a una concentración superior a 12 g/dl.

IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA UTILIZADA Y DE LOS CONTROLES EFECTUADOS EN ESA MUESTRA.

La muestra en esta práctica es de sangre capilar recogida de la porción lateral del pulpejo del quinto dedo.

MATERIAL UTILIZADO.

-   Lanceta

-   Algodón

-   Guantes

-   Bata

-   Vidrio de reloj.

-   Vaso de precipitado de 50 ml.

-   Papel de fieltro.

-   Balanza

-   Varilla agitadora.

-   Matraz aforado de 100 ml.

REACTIVOS

-  Alcohol

-  Solución de sulfato de cobre de una densidad de 1,052 g/dl. Ésta se prepara de la siguiente manera:

§  Disolver 17 g de sulfato de cobre en 100 ml de agua destilada (solución madre).

La densidad de la solución de sulfato de cobre varía con la temperatura. Así pues, por ejemplo, para obtener la misma densidad a una temperatura ambiente de 22 ºC, se han de añadir 0,74 ml más de agua destilada.

§  Mezclar 51 ml de la solución madre con 49 ml de agua destilada.

SECUENCIACIÓN Y PROCEDIMIENTO SEGUIDO (TÉCNICA).

1º  Poner la solución de sulfato de cobre en un vaso de precipitados de 50 ml.

2º  Realizar la punción capilar.

3º  Dejar caer directamente la gota de sangre problema sobre la solución de sulfato de cobre.

DESCRIPCIÓN Y REGISTRO DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON EVALUACIÓN PERSONAL DEL ALUMNO DE LOS MISMO RESULTADOS.

Si la gota de sangre problema es más densa que la solución de sulfato de cobre, cae libremente a través de ella.

Sin embargo, si la gota de sangre problema es menos densa que la solución de sulfato de cobre, no cae al fondo del vaso de precipitados que contiene esta solución.

Una gota de sangre con más de 12 g/dl de Hb tiene una densidad mayor que 1,052 g/cm3.

Si la gota de sangre problema cae libremente a través de la solución de sulfato de cobre, tiene una densidad mayor que 1,052 g/cm3 y, por lo tanto, tiene una concentración de Hb superior a 12 g/dl.

Si la sangre problema tiene una concentración de Hb superior a 12 g/dl, el sujeto puede donar sangre. En el caso contrario la donación no puede ser efectuada.

Por tanto, como en nuestro caso la gota ha caído libremente hasta el fondo del vaso, en un principio, podemos donar sangre.

APLICACIÓN DEL CONTROL DE CALIDAD.

Asegurarse de que los reactivos están en buen estado y, si es necesario, realizar la prueba dos veces.

Realizar un buen lavado del material sin dejar restos de jabón.

NORMAS DE SEGURIDAD Y DE PREVENCIÓN DE RIESGOS LABORALES ESPECÍFICOS DE LA TÉCNICA.

1.      Uso de guantes y bata en el laboratorio.

2.      Llevar el pelo recogido si se tiene largo.

3.      No comer, beber o fumar en el laboratorio.

4.      Uso correcto de los reactivos.

5.      Lugar de trabajo limpio y ordenado.

6.      Desechar la lanceta en el contenedor amarillo del laboratorio, destinado a objetos punzantes. 

CUIDADO DEL MEDIOAMBIENTE.

Al utilizar una cantidad considerable del reactivo, este se ha de desechar en la garrafa destinada a líquidos contaminantes y químicos para que sea recogido y tratada por personal especializado según normativa vigente.

OBSERVACIONES, COMENTARIOS Y CONCLUSIONES.

La determinación de la hemoglobina por el método de sulfato de cobre, es un indicador para determinar si la persona esta acta o no para donar; al no estar acto para la donación este se excluirá por deficiencia de hemoglobina haciéndose contar en los registros la causa de exclusión.

HOJA DE TRABAJO

1º ¿Cuál es el valor mínimo de hemoglobina que debe tener una mujer antes de la donación?

Una mujer ha de tener 12,5 g/dl.

2º ¿Con qué otra solución comparamos la densidad de la sangre?

La comparamos con la solución de sulfato de cobre

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (13-05-15)

Justificación y metodología utilizada

PCR son las siglas en inglés de Polymerase Chain Reaction o Reacción en Cadena de la Polimerasa. La idea básica de la técnica es sintetizar muchas veces un fragmento de ADN utilizando una polimerasa que puede trabajar a temperaturas muy elevadas, ya que proviene de la bacteria Thermus aquaticus que vive a altas temperaturas (79ºC a 85ºC), de ahí su nombre comercial más conocido: taq polimerasa.

Identificacion de la muestra utilizada

Células de la mucosa bucal

Material

•  Hisopos
• Tubos de vidrio
• Microtubos
• Micropipeta 
• Puntas de micropipeta
• Calentador para eppendorf
• Vaso de precipitado
• Pipetas de vidrio graduadas
• Centrifuga especial
• Pipetas Pasteur
• Termociclador
• Balanza electrónica
• Vidrio de reloj
• Cucharilla
• Microondas
• Varilla de vidrio 
• Probeta
• Material para electroforesis
• Portas
• Matraz aforado
• Visualizador
• Luz ultravioleta

Reactivos

• Suero fisiológico
• Matriz instagene
• Oligo 1 y oligo 2
• Tampón 1xTBE
• Agarosa
• Glicerol al 30%
• Tampones de carga
• Colorante de nucleotidos

Secuenciación y procedimiento seguido

1. Con la ayuda de un hisopo frotamos la pared de la mucosa bucal
2. Depositamos el hisopo en 3 ml de suero fisiológico y removemos el suero con el hisopo
3. De esta mezcla cogemos 1,4 ml y lo depositamos en un eppendorf
4. Centrifugamos a 8000 rpm durante 8 minutos
5. Retiramos el sobrenadante con la ayuda de una pipeta de vidrio
6.  Añadimos 70 microlitos de matriz instagene y movemos con la punta de la micropipeta
7. Incubamos 10 minutos a 100ºC y enfriamos a temperatura ambiente
8. Centrifugamos a 13000 rpm durante 30 segundos 
9. Pasamos 10 microlitro a un microtubo y metemos el el congelador para conservar
10. Descongelamos la muestra
11. En el tubo Ready to go PCR añadimos 18,5 microlitros de agua destilada con ayuda de una micropipeta, 2 microlitros de oligo 1 y otros 2 microlitros de oligo 2 (son los primers o cebadores), por último añadimos 2,5 microlitros de la muesta de ADN que se estaba descongelando
12. Le damos un golpe de centrifuga
13. Pasamos los tubos Reade to go PCR al termociclador sin agitarlos
14. Esperamos a que se realicen los ciclos
15. Pesamos en la balanza 1,5 de agarosa, lo disolvemos en 10 ml y enrasamos con agua destilada en un matraz aforado de 100 ml
16. Fundimos la agarosa completamente en el microondas
17. Dejamos enfriar y añadimos 5 microlitros del colorante de nucleotidos
18. Depositamos el gel de agarosa en la bandeja de electroforesis
19. Dejamos solidificar
20. Una vez solidificado cubrimos con tampón 1xTBE 
21. Quitamos lo peines con cuidado de no romper los pocillos
22. Colocamos el control en los dos pocillos de los extremos superiores y en los dos de los extremos inferiores
23. En el resto de los pocillos ponemos 5 microlitros del tampón de carga correspondiente y 5 microlitros de la muestra de ADN 
24. Le aplicamos la corriente, 120 voltios durante 30 minutos
25. Una vez finalizada la electroforesis se visualizan los fragmentos mediante luz ultravioleta

Descripción y registro de los resultados obtenidos 

Teniendo en cuenta que el control haya salido bien las bandas de los pocillos indican el resultado de esta practica con respecto al control.

Aplicaciones del control de calidad

Debemos comprobar que el control sea correcto

Normas de prevención de riesgos laborales

1.      Uso de guantes y bata en el laboratorio.

2.      Llevar el pelo recogido si se tiene largo.

3.      No comer, beber o fumar en el laboratorio.

4.      Uso correcto de la centrifuga y baño de agua.

5.      Lugar de trabajo limpio y ordenado.

Cuidado del medio ambiente

Se deberán lavar todos los materiales como correspondan y se deberán desechar los reactivos a su lugar correspondiente

Observaciones, comentarios y conclusiones

El importante tener en cuenta que cuando se vaya a utilizar la PCR la secuencia de oligonucleotidos que se usara como cebador es uno de los parámetros mas importantes debido a su alta sensibilidad y a que puede ser muy susceptible a contaminarse, por eso es importante tener un ADN de control negativo para controlar esta variable, se deben separar las áreas de las muestras pre PCR, los productos de la reacción post PCR, las soluciones y esterilizar los materiales

Determinación Du (20-05-15)

JUSTIFICACIÓN DE LA TÉCNICA Y METODOLOGÍA UTILIZADA.

En algunos casos, los anticuerpos tipo IgG (o incompletos) son incapaces de producir la aglutinación de los hematíes por sí solos. Sin embargo, son capaces de adherirse a su superficie tato in vivo como in vitro, y decimos que han sensibilizado a los hematíes. También son capaces de fijar el complemento, sin llegar a producir la hemólisis de los eritrocitos.

Estos anticuerpos de tipo IgG, pueden reaccionar con un suero de conejo en el que existen anticuerpos antiglobulina humana del tipo IgM (completos). Como resultado de esta reacción es la aglutinación de los hematíes.

Este suero antiglobulina humana es lo que se conoce como suero de Coombs, que puede ser de dos tipos:

·         Poliespecífico, si está dirigido contra la IgG o contra el componente C3d del complemento.

·         Monoespecífico, si está dirigido sólo contra la IgG o contra alguno de los componentes de complemento.

La prueba de Combs o de la antiglobulina humana puede realizarse de dos modos:

1.      Prueba directa, donde intentamos detectar anticuerpos incompletos que han sensibilizado a los hematíes in vivo y para lo que enfrentamos directamente el suero de Combs y observamos si existe o no, aglutinación.

2.      Prueba indirecta, donde el paso previo es la sensibilización de los eritrocitos in vitro, para posteriormente hacerlos reaccionar con el suero de Combs. En este caso se buscan anticuerpos incompletos libres en el suero, o poner de manifiesto la presencia de antígenos débiles en la membrana de los hematíes

El D^u es un antígeno débil que no se pone de manifiesto en las pruebas normales de determinación del Rh. Por ello se debe sensibilizar previamente los hematíes problema con un suero que contiene anticuerpos D, y posteriormente enfrentarlos al suero de Coombs. Si existe el antígeno D^u en la superficie de los eritrocitos, se producirá la unión de los anticuerpos anti-D a sus receptores de membrana, y en la segunda fase darán lugar a la aglutinación en presencia del suero antiglobulina humana.

Esta práctica es, por tanto, una prueba de Combs indirecta.

IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA UTILIZADA Y DE LOS CONTROLES EFECTUADOS EN ESA MUESTRA.

Hematíes de la sangre problema previamente lavados tres veces en solución salina fisiológica y suspendidos al 5% en dicha solución.

MATERIAL UTILIZADO.

-   Papel de filtro.

-   Bata y guantes.

-   Tubos de centrífuga.

-   Tapones.

-   Centrífuga.

-   Baño de agua.

-   Pipetas Pasteur de vidrio.

-   Reloj.

-   Gradilla.

-   Micropipetas

-   Puntas de micropipetas.

REACTIVOS

·         Suero anti-D humano.

·         Suero antiglobulina humana de conejo (suero de Combs)

·         Solución salina fisiológica

SECUENCIACIÓN Y PROCEDIMIENTO SEGUIDO (TÉCNICA).

1.      Lavar los hematíes tres veces como en la práctica anterior.

2.      Preparar la suspensión de hematíes al 5% con 1,9 ml de suero y 0,1 ml de hematíes lavados.

3.      En un tubo, poner una gota de suero anti-D y una gota de suspensión de hematíes al 5%.

4.      Mezclar bien e incubar a 37ºC durante 35-40 minutos.

5.      Volver a lavar los hematíes incubados tres veces más con 3 ml de suero.

6.      Añadir una gota del suero Coombs y mezclar suavemente.

7.      Centrifugar a 1000 rpm durante un minuto.

DESCRIPCIÓN Y REGISTRO DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON EVALUACIÓN PERSONAL DEL ALUMNO DE LOS MISMO RESULTADOS.

Para la lectura de resultados observamos la aparición o no de aglutinación, mediante golpes suaves en el fondo del tubo. En caso de duda, se observa al microscopio entre porta y cubreobjetos con el microscopio de 40x.

Si existe aglutinación, el resultado es positivo e indica que la membrana de los hematíes hay antígeno D^u y se clasifica la sangre como Rh positivo variante de D^u.

En el caso de no existir aglutinación, la sangre se clasifica como Rh negativo

El resultado que he obtenido es que no me a aglutinado en ninguno de los pasos por lo tanto el Rh es negativo  

APLICACIÓN DEL CONTROL DE CALIDAD.

Con el fin de evitar falsos positivos, debido a una sensibilización de los hematíes in vivo, se debe realizar una prueba de Coombs directa con los hematíes problema, lo que servirá como control negativo.

También hay que asegurarse de que los reactivos no estén caducados y trabajar con la muestra por un periodo de tiempo no superior a 72 horas.

El lavado inadecuado de los hematíes, la contaminación de los reactivos con trazas de suero, tiempos de incubación y centrifugado incorrectos, mal control de la temperatura e inadecuada conservación u omisión de los reactivos dan reacciones negativas falsas.

NORMAS DE SEGURIDAD Y DE PREVENCIÓN DE RIESGOS LABORALES ESPECÍFICOS DE LA TÉCNICA.

1.      Uso de guantes y bata en el laboratorio.

2.      Llevar el pelo recogido si se tiene largo.

3.      No comer, beber o fumar en el laboratorio.

4.      Uso correcto de la centrifuga y baño de agua.

5.      Lugar de trabajo limpio y ordenado.

CUIDADO DEL MEDIOAMBIENTE.

Tanto los tubos como el material utilizado, se pueden lavar en el fregador.

OBSERVACIONES, COMENTARIOS Y CONCLUSIONES.

A diferencia de la prueba de Coombs directa, la prueba indirecta se basa en la "incubación" del suero del paciente con una muestra de sangre tipo O, y posteriormente se procede a administrar el "anti-suero". A diferencia de la prueba directa, en la prueba indirecta se busca la presencia de "anticuerpos" en el suero del paciente y no "anticuerpos" pegados a la superficie de los glóbulos rojos. La prueba indirecta se usa para realizar "tipificación" de grupos sanguíneos, pruebas sanguíneas cruzadas y como método de rastreo para evitar reacciones transfusionales.

HOJA DE TRABAJO

1º ¿Qué contiene el suero de Coombs?

El suero de Coombs contiene suero de conejo anti-IgG humana purificada.

2º ¿Qué se detecta con la prueba directa?

Con la prueba directa de Coombs se detecta anticuerpos incompletos que han sensibilizado a los hematíes in vivo.

3º ¿Qué podemos detectar con la prueba indirecta?

Con la prueba indirecta, podemos detectar los anticuerpos incompletos libres en el suero o poner de manifiesto la presencia de antígenos débiles en la membrana de los hematíes

4º. ¿Qué buscamos en la sangre del paciente?

Antígenos D^u

5º. ¿Qué ocurre si el control es positivo?

Si el resultado obtenido es positivo, nos indica que en la membrana de los hematíes hay antígeno D^u y se clasifica como Rh+ Variante de D^u.